Спиннинг-диск (Spinning-disk) микроскопия — Конфокальный микроскоп

В конфокальном микроскопе, благодаря пинхолу, проводится детекция флуоресценции в одном участке объекта, находящемся в фокусе, с минимальным влиянием флуоресценции окружающих участков за счет перестройки оптической конструкции в каждый момент времени. Такой способ позволяет значительно повысить разрешающую способность по всем трём осям, и избежать засвечивания от подлежащих слоёв образца и лежащих над плоскостью наблюдения. В качестве светового источника используется лазер. За линзой объектива находится небольшая диафрагма. Это нужно чтобы испускаемый световой луч проходил через нее и регистрировался, а свет других фрагментов задерживался диафрагмой, и лазер освещает не все поле зрения. В результате визуализация по данному методу проводится в рамках одного оптического среза. В ходе работы проводится съёмка серии оптических срезов образца или перестройки, на основании чего можно получить его трёхмерную реконструкцию^[1]. Однако необходимость сканирования множества участков замедляет процесс работы, и конфокальный микроскоп может получить всего несколько изображений в секунду^[2]. Ещё одним фактором, замедляющим работу конфокальных микроскопов, является переход от одного оптического среза к следующему. Сканирующие, как правило, основаны на следующем принципе: предмет фиксируется на определённом уровне, изображение считывается под контролем гальванометрического сканера, затем поле исследования перемещается по вертикальной оси и процедура повторяется^[1]. Ускорить процесс сканирования можно сократив затраты времени на каждую точку, но это снижает чувствительность метода и соотношение сигнал/шум. Скорректировать падение чувствительности можно было бы путём повышения интенсивности освещения, но в этом случае возможно повреждение исследуемого материала светом и его обесцвечивание^[3]. Микроскоп - это техническое устройство, позволяющее проводить измерения и анализ различных образцов. В современных лабораториях используются специальные научные микроскопы для изучения свойств разных материалов. 

В конфокальной установке единичный пинхол заменяется множеством пинхолов, обеспечивающих освещение и получение визуализации многих областей образца единовременно. Эти пинхолы расположены на вращающемся по спирали, обеспечивая, в итоге, равномерное освещение^[4]. Чтобы между отверстиями не происходило засвечивания, они должны находиться на расстоянии, равном десяти их диаметрам, друг от друга^[1]. С помощью подобных приборов можно получить изображение препарата гораздо быстрее - за одну секунду через описываемые микроскопы можно получать десятки и сотни изображений.

Конфокальная микроскопия сочетает возможность наблюдения тонких оптических срезов, с высокой чувствительностью флуоресцентной микроскопии. Метод хорошо подходит для исследований динамики цитоскелета, движения везикул и органелл, и других задач, связанных с прижизненным наблюдением клеток. Он является более щадящим по отношению к живым микроорганизмам благодаря тому, что продолжительность освещения каждого участка значительно сокращается по сравнению обычным микроскопом. Устройство можно собрать как на прямом, так и на инвертированном микроскопе, но, всё же, предпочтительно использовать инвертированный^[2], поскольку такой дизайн дает возможность исследовать живые микрообъекты и клеточные культуры.

Для съёмки путём микроскопии инструмент может использоваться c камерой ПЗС, а не детекторы на основе фотоумножителей. Детекция с использованием фотоумножителя позволяет значительно усилить сигнал, но создаёт дополнительные шумы. Охлаждаемые ПЗС-камеры микроскопа, напротив, позволяют получать прижизненные изображения крупного формата, с меньшим количеством шумов^[4].

Двойная конфокальная система была предложена компанией Yokogawa Electric Corporation. Вторая фокусирующая конструкция при этом расположена так, чтобы встроенные в него линзы располагались перед отверстиями на первом, он осуществляет фокусирование света. Сейчас это наиболее распространённые механизмы для сборки конфокальных микроскопов. Размер используемых в них пинхолов фиксирован, он оптимален 100× увеличения. Пинхолы систем Yokogawa имеют диаметр 50 мкм, через каждый из них может быть получено изображение фрагмента оптического среза диаметром 500 нм. Синхронизация скорости и длительности съёмки определяет его качество^[4].

При использовании эффекта полного внутреннего отражения (TIRF) микроскопа можно получить сведения о процессах, происходящих в тонком поверхностном слое образца, например, непосредственно под мембраной. Для этого используется рассеяние небольшого количества света в виде затухающей волны при полном внутреннем отражении лазерного луча на границе раздела сред. Система, работающая на данном принципе, может быть объединена с конструктивной структурой в составе одного конфокального микроскопа. Для переключения между режимами необходима турель, удаляющая фильтры при микроскопии с использованием переключения между камерами. Методики активного освещения - фотообесцвечивание, фотоактивация и фотоконверсия флуорохромов, предназначены для исследования динамических процессов в клетке. Они могут быть реализованы на микроскопе, оснащённом данным способом лазерной сканирующей микроскопии, с использованием отдельных источников иллюминации. В сканирующих модулях фотообесцвечивание проводится с помощью того же лазера, что и получение изображения за счёт изменения его интенсивности, в результате одновременно проводить эти процедуры нельзя, что затрудняет исследование молекул с высокой подвижностью^[4]. Для качественной обработки полученных картинок требуются большие вычислительные мощности компьютера. Производители медицинского оборудования выпускают новейшие образцы данного вида оборудования, которые разделяют лазерный луч возбуждения и люминесценцию. Оборудование получило широкое применение в области биофизики, медицины, молекулярной и клеточной биологии.

Таким образом, спиннинг диск конфокальная микроскопия представляет собой экономичный и точный способ исследования биологического материала с высоким разрешением, во многом заменяющий микроскопию, прежде всего при решении задач, связанных с наблюдениями за живыми объектами. Развитие метода и разработки компании Andor позволили создать конфокальные механизмы, позволяющие работать без использования лазеров, что снизило стоимость оборудования для исследований подобного класса.

 

1. Wilson T. Spinning-disk microscopy systems / Cold Spring Harb Protoc. 2010. - 2010. - V.11.
2. Thorn K. Spinning-disk confocal microscopy of yeast / Methods Enzymol.- 2010. V. 470.- P.581-602.
3. Winter PW, Shroff H. Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging / Curr Opin Chem Biol. - 2014. - V.20. - P. 46-53.
4. Stehbens S, Pemble H, Murrow L et al. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods Enzymol. - 2012. - V.504. - P.293-313.

 

 

 

 

Конфокальный микроскоп Nikon. Дендритная клетка, выделенная из костного мозга, экспрессирующая химерный белок MHC II -GFP ( 5 мкм). Vyas JM. Insights into dendritic cell function using advanced imaging modalities / Virulence. - 2012. - V.3, N.7. - P. 690-694. 

 

 

Прижизненное изображение распределения нейтрофилов в эмбрионе D. rerio. A,B - конфокальная микроскопия, C, D. Lam PY1, Fischer RS, Shin WD, Waterman CM, Huttenlocher A. Spinning disk confocal imaging of neutrophil migration in zebrafish / Methods Mol Biol. - 2014. - V.1124. - P.219-33. 

Обычные классические микроскопы не всегда эффективны при проведении сложных исследований. Если для наблюдения крупных объектов их качеств бывает достаточно, то при исследовании микроорганизмов они дают искажения. Конфокальные приборы лишены многих недостатков обычного микроскопа. В них есть важный элемент – диафрагма, – который отсекает поток фонового рассеянного света.

Каждую единицу времени регистрируется визуализация только от одной точки объекта. Это реализуется за счет диафрагмы, расположенной за линзой объектива. Она пропускает свет от одной точки, а свет от других задерживается. В следующий момент времени конфокальное устройство перестраивается (либо перемещается микрообразец), и в диафрагму попадает свет от другой точки. Затем все они складываются в единую картину.

В соответствии с рассматриваемым методом, лазером освещается не весь образец, а только определенный его фрагмент, свечение от которого и попадает в диафрагму. Соседние области становятся вторичными источниками, но диафрагма их отсекает. Регулируя диаметр диафрагмы, наблюдатель может точно устанавливать толщину оптического слоя у фокуса лазерного луча. Тем самым обеспечивается более качественное изображение по оси Z, что является проблемой для многих обычных микроскопов.

Управляет оптической установкой компьютер. Наблюдателю не нужно смотреть в окуляр: картинка обрабатывается программой и выводится на экран монитора. Очень важно правильно установливать микроскопы, так как они чувствительны к вибрациям. Для удобства работы и передачи информации, компьютер микроскопа оснащается USB-портами и возможностью подключения к локальной сети и Интернет. Жесткий диск должен быть вместительным, чтобы хранить большое количество информации.