Медико-биологические микроскопы Nikon
Москва
+7 (495) 787 40 46
Санкт-Петербург
+7 (812) 305 06 06

Микроскопия PALM — технологии будущего, которые работают уже сегодня

 

 Фотоактивируемая локализационная микроскопия ( PALM или FPALM ) и стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (STORM) являются широко распространенными (в отличие от методов точечного сканирования, таких как лазерная сканирующая конфокальная микроскопия) методами визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии, которые позволяют получать изображения с разрешением выше дифракционного предела . Методы были предложены в 2006 году после общего появления методов оптической микроскопии сверхвысокого разрешения и были описаны в журнале Nature Methods как «Методы года 2008». Развитие PALM как целевого метода биофизической визуализации было в значительной степени вызвано открытием новых видов и созданием мутантов флуоресцентных белков, проявляющих управляемый фотохромизм, таких как фотоактивируемый GFP. Тем не менее, сопутствующая разработка STORM, основанная на том же фундаментальном принципе, изначально использовала парные цианиновые красители. Одна молекула пары (называемая активатором), когда она возбуждена вблизи максимума своего поглощения, служит для реактивации другой молекулы (называемой репортером) в флуоресцентное состояние.

Растет число красителей, используемых для PALM, STORM и связанных с ними технологий, как органических флуорофоров, так и флуоресцентных белков. Некоторые из них совместимы с визуализацией живых клеток, другие позволяют более быстрое получение или более плотную маркировку. Выбор конкретного флуорофора в конечном итоге зависит от применения и его основных фотофизических свойств.

Оба метода претерпели значительные технические усовершенствования, в частности, позволив многоцветную визуализацию и расширение до трех измерений, с наилучшим текущим осевым разрешением 10 нм в третьем измерении, полученным с использованием интерферометрического подхода с двумя противоположными целями, собирающими флуоресценцию из образец.

Принцип 

Обычная флуоресцентная микроскопия выполняется путем селективного окрашивания образца флуоресцентными молекулами, либо связанными с антителами, как в иммуногистохимии, либо с использованием флуоресцентных белков, генетически слитых с интересующими генами. Как правило, чем более сконцентрированы флуорофоры, тем лучше контраст флуоресцентного изображения.

Один флуорофор можно визуализировать под микроскопом (или даже под невооруженным глазом), если количество испускаемых фотонов достаточно велико, а фон, напротив, достаточно низок. Двумерное изображение точечного источника, наблюдаемого под микроскопом, представляет собой расширенное пятно, соответствующее диску Эйри (раздел функции рассеяния точки) системы формирования изображения. Способность идентифицировать как два отдельных объекта два близко расположенных флуорофора ограничена дифракцией света.

Предел теоретического разрешения при самой короткой практической длине волны возбуждения составляет около 150 нм в поперечном измерении и приближается к 400 нм в осевом измерении (если используется объектив с числовой апертурой 1,40 и длиной волны возбуждения 400 нм).

Однако, если излучение от двух соседних флуоресцентных молекул сделано различимым, то есть фотоны, приходящие от каждой из двух, могут быть идентифицированы, тогда можно преодолеть дифракционный предел. Как только набор фотонов из конкретной молекулы собирается, он образует ограниченное дифракцией пятно в плоскости изображения микроскопа. Центр этого пятна может быть найден путем подгонки наблюдаемого профиля излучения к известной геометрической функции, обычно гауссовой функция в двух измерениях.

Ошибка, которая допускается при локализации центра точечного излучателя, масштабируется до первого приближения как обратный корень квадратный из числа испущенных фотонов, и, если собрано достаточное количество фотонов, легко получить ошибку локализации, намного меньшую, чем исходная точка функция распространения.

Несколько близко расположенных излучателей неразличимы. Положение точечного источника может быть восстановлено только в том случае, если испущенные им фотоны были идентифицированы из тех, которые возникают из соседних молекул.

Два этапа идентификации и локализации отдельных флуоресцентных молекул в плотной среде, где их много, лежат в основе PALM, STORM и их развития.

Хотя существует много подходов к молекулярной идентификации, светоиндуцированный фотохромизм отдельных флуорофоров развивается как наиболее перспективный подход для различения соседних молекул путем разделения их флуоресцентного излучения во времени. Включая стохастически разреженные подмножества флуорофоров светом определенной длины волны, отдельные молекулы могут затем возбуждаться и отображаться в соответствии с их спектрами. Чтобы избежать накопления активных флуорофоров в образце, которые в конечном итоге могут ухудшиться до дифракционно-ограниченного изображения, в PALM используется самопроизвольно возникающее явление фотообесцвечивания, тогда как обратимое переключение между флуоресцентным включенным состоянием и темным выключенным состоянием краситель эксплуатируется в STORM.

Таким образом, PALM и STORM основаны на сборе под флуоресцентным микроскопом большого количества изображений, каждое из которых содержит всего несколько активных изолированных флуорофоров. Последовательность визуализации обеспечивает множество циклов излучения, необходимых для стохастической активации каждого флуорофора из неэмиссионного (или менее эмиссионного) состояния в светлое состояние и обратно в неэмиссионное или отбеленное состояние. В течение каждого цикла плотность активированных молекул поддерживается на достаточно низком уровне, чтобы молекулярные изображения отдельных флуорофоров обычно не перекрывались.

Локализация отдельных флуорофоров

На каждом изображении последовательности положение флуорофора вычисляется с точностью, обычно превышающей предел дифракции - в типичном диапазоне от нескольких до десятков нм, - и полученную информацию о положении центров всех локализованных Молекулы используются для создания изображения PALM или STORM с супер-разрешением.

Требование одновременной локализации нескольких флуорофоров на расширенной области определяет причину, по которой эти методы широко используются, в качестве детектора используются CCD , EMCCD или CMOS камера.

Требование к улучшенному отношению сигнал / шум для максимизации точности локализации определяет частую комбинацию этой концепции с широкопольными флуоресцентными микроскопами, обеспечивающими оптическое сечение, такими как флуоресцентные микроскопы с полным внутренним отражением (TIRF) и флуоресцентные микроскопы с легким листом.

Изображение с супер-разрешением

Разрешение конечного изображения ограничено точностью каждой локализации и количеством локализаций, а не дифракцией. Следовательно, изображение с высоким разрешением является пуантилистическим представлением координат всех локализованных молекул. Изображение с высоким разрешением обычно визуализируется путем представления каждой молекулы в плоскости изображения в виде двумерного гауссиана с амплитудой, пропорциональной количеству собранных фотонов, и стандартным отклонением в зависимости от точности локализации.

Приложения

Многоцветный PALM / STORM

Особые фотофизические свойства флуорофоров, используемых в изображениях с высоким разрешением PALM / STORM, создают как ограничения, так и возможности для многоцветной визуализации. До настоящего времени появилось три стратегии: возбуждение спектрально разделенных флуорофоров с помощью светоделительного луча, с использованием нескольких активаторов / репортеров в режиме STORM и ратиометрическое отображение спектрально близких флуорофоров.

3D в PALM и STORM

Хотя первоначально PALM и STORM изначально разрабатывались как 2D (x, y) методы визуализации, они быстро превратились в 3D (x, y, z) методы. Для определения осевого положения одного флуорофора в образце в настоящее время используются следующие подходы: модификация функции рассеяния точки для введения z-зависимых признаков в 2D (x, y) -изображение (наиболее распространенный подход заключается во введении астигматизма в PSF); многоплоскостное обнаружение , где осевое положение определяется путем сравнения двух изображений одного и того же PSF, расфокусированных одно относительно другого; интерферометрическое определение осевого положения излучателя с использованием двух противоположных объективов и нескольких детекторов; использование временной фокусировки ограничить возбуждение / активацию; использование возбуждения / активации светового листа для ограничения слоя толщиной в несколько сотен нанометров, произвольно расположенного вдоль z-плоскости в образце.

Визуализация живых клеток

Требование нескольких циклов активации, возбуждения и деактивации / обесцвечивания обычно подразумевало бы длительные периоды времени для формирования изображения PALM / STORM и, следовательно, работу с фиксированным образцом. Ряд работ был опубликован еще в 2007 году выполняя PALM / STORM на живых клетках. Способность выполнять визуализацию с высоким разрешением в реальном времени с использованием этих методов в конечном итоге зависит от технических ограничений, связанных со сбором достаточного количества фотонов из одного излучателя за очень короткое время. Это зависит как от фотофизических ограничений зонда, так и от чувствительности используемого детектора. Относительно медленные (от секунд до десятков секунд) процессы, такие как изменение в организации очаговых спаек , были исследованы с помощью PALM, в то время как STORM позволил получать изображения более быстрых процессов, таких как мембранная диффузия клатрин-покрытых ям или митохондриальные процессы деления / слияния. Многообещающим применением PALM для живых клеток является использование фотоактивации для выполнения одночастичного отслеживания высокой плотности (sptPALM), преодолевая традиционное ограничение отслеживания отдельных частиц для работы с системами, показывающими очень низкую концентрацию флуорофоров.

Нанофотонные взаимодействия

В то время как традиционные измерения PALM и STORM используются для определения физической структуры образца, а интенсивности флуоресцентных событий определяют достоверность локализации, эти интенсивности также можно использовать для картирования взаимодействий флуорофора с нанофотонными структурами. Это было выполнено как на металлических (плазмонных) структурах, таких как золотые наностержни, так и на полупроводниковых структурах, таких как кремниевые нанопроволоки. Эти подходы могут быть использованы либо для флуорофоров, функционализированных на поверхности представляющего интерес образца (как в упомянутых здесь исследованиях плазмонных частиц), либо для случайной адсорбции на подложке, окружающей образец, позволяющей полное 2D-картирование взаимодействий флуорофор-наноструктура во всех положениях относительно структуры. 

Эти исследования показали, что, в дополнение к стандартной неопределенности локализации из-за подгонки функции рассеяния точки, самоинтерференция со светом, рассеянным наночастицами, может привести к искажению или смещению отображаемых функций рассеяния точки, усложняя анализ таких измерений. Тем не менее, их можно ограничить, например, путем включения метасферных масок, которые контролируют угловое распределение света, разрешенное в измерительной системе. 

Различия между PALM и STORM

PALM и STORM имеют общий фундаментальный принцип, и многочисленные разработки привели к тому, что эти две технологии стали еще более взаимосвязанными. Тем не менее, они отличаются несколькими техническими деталями и фундаментальным моментом. С технической стороны, PALM выполняется на биологическом образце с использованием флуорофоров, экспрессируемых экзогенно в форме генетических слитых конструкций с фотоактивируемым флуоресцентным белком. Вместо этого STORM использует иммунную метку эндогенных молекул в образце антителами, меченными органическими флуорофорами. В обоих случаях флуорофоры загораются между активным включенным и неактивным выключенным светом. В PALM, однако, фотоактивация и фотообесцвечивание ограничивают жизнь флуорофора ограниченным интервалом времени, и непрерывное излучение флуорофора желательно между ними без какой-либо флуоресцентной перемежаемости. Фотосвязывание органических флуорофоров (обычно ярче, чем флуоресцентные белки) первоначально использовалось для разделения соседних красителей. В этом отношении, чем сильнее мигание, тем выше вероятность различения двух соседних флуорофоров.

В связи с этим в нескольких исследовательских работах изучался потенциал PALM для количественного определения количества флуорофоров (и, следовательно, представляющих интерес белков), присутствующих в образце, путем подсчета активированных флуорофоров. Подход, используемый для обработки флуоресцентной динамики флуоресцентной метки, используемой в экспериментах, будет определять окончательный вид изображения с суперразрешением и возможность определения однозначного соответствия между событием локализации и белок в образце.

 

 

Вернуться наверх
Обратный звонок
Напишите нам