Медико-биологическиеСистемы культивирования клеток

Системы культивирования клеток



Биостанции Nikon-это уникальные системы культивирования клеток, выводящие современную микроскопию на качественно новую ступень исследований.

Возможность задания необходимых параметров среды и их точного контроля позволяет проводить длительные наблюдения и изучение живых клеток в лаборатории или дистанционно. Встроенные непосредственно в инкубационную систему биостанции инвертированный микроскоп и цифровая камера избавляют от необходимости постоянной корректировки условий содержания клеток, которая возникает при извлечении культуры из инкубатора, и сводят к минимуму риск клеточного стресса и контаминации. Оператор в любое время может оценить состояние культуры и получить ее изображение или вести регистрацию роста и изменений морфологии изучаемых объектов и экспрессии генов, задав нужный протокол анализа.

 
 

Биостанция Nikon IM-Q - это компактная система инкубации и мониторинга клеточных культур, позволяющая пользователям, обладающим лишь минимальным опытом работы с микроскопами, проводить исследования живых клеток без специальной сложной профессиональной подготовки. Биостанция Nikon IM-Q упрощает и ускоряет проведение краткосрочных и длительных экспериментов с получением изображений через заданные промежутки времени, включая исследования клеточного роста, морфологии и экспрессии белков, обеспечивая при этом поддержание стабильной температуры, влажности и концентрации газа, а также позволяет получать высококачественные изображения методами фазового контраста и флуоресценции. Кроме того, исследователям предоставляется возможность выбора из двух типов камер. Благодаря перфузии возможности экспериментов расширяются еще больше. 

Биостанция Nikon CT позволяет проводить эксперименты с клеточными культурами, не вынимая емкости с культурами из инкубатора для их микроскопического исследования. Биостанция, включающая стандартный клеточный инкубатор вместе с инвертированным микроскопом, может одновременно содержать 30 сосудов различной формы, начиная от 24-луночных планшетов до 75-см2 бутылей, которые перемещаются между микроскопом и станцией хранения с помощью роботизированной руки. Внутренняя среда инкубатора постоянно контролируется с помощью множества датчиков для поддержания стабильного уровня концентрации газа CO2, влажности и температуры. 


Биостанции от компании Nikon идеально подходят для долгосрочных испытаний с необходимостью непрерывного мониторинга и получения контрастных изображений исследуемых образцов. При этом исследователю необязательно постоянно присутствовать в лаборатории - мощное программное обеспечение позволяет сохранять все данные в системе и использовать их даже в удаленном режиме.

В Санкт-Петербурге купить микроскоп или биостанцию можно, обратившись к официальному представителю Nikon в России - компании Биовитрум. У нас вы можете купить микроскопы с доставкой в Нижний Новгород, Новосибирск или другие регионы страны.

 

Системы культивирования иммобилизованных клеток

Современные биостанции предполагают два способа культивирования иммобилизованных клеток:

1.     Выращивание клеток происходит в горизонтальном сосуде (системы культивирования с плоской основой);

2.     Выращивание клеток в биостанции происходит в вертикально расположенном сосуде (так называемые системы колоночной культуры).

Общим у этих систем является то, что находятся в неподвижном состоянии, в то время как вокруг них циркулирует жидкая среда. Рассмотрим обе методики более подробно:

Системы культуры с плоской основой

Прежде всего, такая система нуждается в стеклянном сосуде. Как правило, его объем составляет 300-350 мл; при этом высота сосуда в 2-2,5 раза меньше его длины (то есть сосуд - «плоский», а не вытянутый вверх). На дне сосуда находится субстрат (нетоксичная полипропиленовая ткань), на котором размещается 40-50 г клеток. Над этой массой на специальном держателе закреплен второй сосуд меньшего объема, содержащий питательную среду. Эта среда капает на клетки и «проходит» сквозь них, оставляя им часть питательных веществ. Дозировку питательной среды можно регулировать; после использования она откачивается насосом со дна сосуда для культивирования и возвращается в верхнюю емкость для повторного использования.

Проведенные учеными исследования доказывают эффективность такого метода культивирования. Например, клетки Solanum niger, для культивации которых была использована плоская основа (среда Мурасиге-Скуга с добавлением 2,4-Д и кинетина), оперативно реагировали на недостаток ортофосфата и потребляли питательную среду. Количество жизнеспособных клеток при этом достигает 70-80%, а сырая масса нарастает гораздо медленнее, чем при использовании суспензионных культур. Для сравнения ученые приводят следующие показатели: через неделю культивирования при использовании системы с плоской основой количество алкалоидов достигает до 12 мг/г сухой массы, в то время как в суспензии такой же показатель не достигается даже в течение 18 дней и составляет всего 10 мг/г сухой массы.

Исследователи отмечают, что на образцах, расположенных непосредственно под емкостью с питательной средой, культивируемая ткань через 3-4 дня темнела и выделялась на фоне остальных клеток, которые имели светло-бежевый оттенок. Кроме этого, в той зоне, где падали капли питательной среды, плотность клеток сама по себе была более высокой, а уровень алкалоидов в этих клетках превышал их концентрацию у «соседей». В то же время, когда эти клетки были лишены «привилегированных» условий, они возвращались к прежнему состоянию и развивались так же, как и остальные клетки.

Еще один опыт, который был проведен с клетками, иммобилизованными на плоской основе, заключался во введении предшественников вторичных метаболитов. Когда в образец было добавлено всего лишь 5 мл изокаприновой кислоты, синтез капасцина в исследуемых клетках увеличивался в тысячу и более раз. Отдельно отмечалось, что синтезируемый капасцин не оставался в клетках, а секретировался в питательную среду.

Помимо этого, ученые установили, что системы с плоской основой позволяют клеткам потреблять питательные вещества (в том числе и кислород) из внешней среды. Что касается взаимного расположения клеток, то было обнаружено, что они имеют каллусоподобное расположение и способны к тесному межклеточному контакту.

Несмотря на все описанные преимущества, горизонтальные биостанции  - системы культивирования не пользуются популярностью в среде биотехнологов. Все дело в том, что использование низких, но широких, сосудов занимает большую площадь и не позволяет вырастить необходимый объем клеток в ограниченных условиях. Эта проблема решается применением второй системы, речь о которой пойдет ниже.

Системы культивирования в вертикально расположенном сосуде

Если сравнивать биостанции: вертикально расположенные системы с горизонтальными, то можно отметить один общий признак - питательная среда во всех системах по одной капле падает на клетки, расположенные на субстрате. Отличие заключается в том, что во втором варианте биостанции системы клетки распределены по всему объему вертикально стоящего сосуда. Таким образом, питательное вещество проходит насквозь через узкий «столб», не оставляя без внимания большие участки материала. Подобно плоской емкости, питательная среда подбирается со дна вертикального сосуда насосом и используется повторно.

Поскольку любое вещество, в том числе и клетки, подвержено силе всемирного тяготения и стремится «растечься» по поверхности, возникает необходимость равномерного их распределения внутри вертикального сосуда. Для этого небольшие массы, содержащие клетки, помещают в нейлоновые корзинки, закрепляя их при помощи специального геля. Между корзинками в сосуде находится воздушное пространство, которое дает возможность протекания питательных веществ сквозь всю толщу сосуда. При этом корзинки не изолированы друг от друга: во время роста клетки вполне могут выходить за пределы нейлоновых стенок и контактировать друг с другом.

В качестве подложки и основного несущего вещества для клеток применяется агар или альгинат кальция. Наилучший материал для плетения корзинок - нейлоновые мочалки. Этот материал легко обрабатывается и способен выдержать высокую температуру и давление при стерилизации в автоклаве.

Чтобы подготовить систему, прежде всего, необходимо сделать субстрат. Для этого следует взять 2% раствор агара в дистиллированной воде и поместить в автоклав на 20 минут, выставив давление в 1 атмосферу. После этого полученную жидкость охлаждают на водяной бане до 35-40°С, параллельно подготавливая клетки для будущей работы. Для этого суспензионную культуру во время стационарной фазы роста фильтруют через сито с размером ячейки 1 мм, после чего в равных частях перемешивают с незастывшим агаром. Далее, в полученную смесь при помощи стерильного пинцета погружают заготовки будущих корзинок из нейлоновой мочалки. Их размеры должны быть такими, чтобы после застывания агара в корзинках помещалось 2-3 мл смеси клеток и субстрата. Затем 8-10 таких корзинок помещают в высокие и узкие стеклянные сосуды, в которых и будет происходить культивация клеток. Всего же в сосуде размещается 5-7 г сырой массы клеток.

Если же вместо агара в качестве подложки используется альгинат кальция, в технологический процесс добавляется стерильный раствор хлорида кальция. В него добавляется смесь альгинта и клеток, которая подготавливается заранее. Хлорид кальция нужен для того, чтобы получившаяся смесь затвердела вокруг корзинок из нейлоновой мочалки, которые также погружаются в раствор. Полученные отвердевшие образы промывают в дистиллированной воде в течение трех циклов, после чего размещают в вертикальном сосуде. Исследования подтверждают, что использование альгината кальция предпочтительнее, так как рост клеток в такой системе имеет более хорошие показатели, чем при использовании агара в качестве субстрата. Природа этого явления еще не выяснена до конца, однако относительно низкие показатели агара связаны, скорее всего, с его негативным воздействием на клетки в процессе застывания.

Если сравнивать вертикальные системы с плоскими, то ученые отмечают, что скорость потребления питательных веществ в них несколько ниже, нежели в горизонтальных системах. Содержание алкалоидов через 8-10 дней составляет примерно 12-13 мг/г сухой массы, pH среды через 8 суток снижается до 5,4, а жизнеспособность клеток держится на уровне 60-65% по сравнению с суспензионными культурами. Также есть неподтвержденные предположения, что примерно на 4-8 сутки культивации клетки испытывают недостаток кислорода.

 

Общим фактором для обеих систем культивирования иммобилизованных клеток является освещение. Опыты ожидаемо показали, что при использовании ламп дневного света клетки интенсивнее потребляют питательные вещества и лучше растут. Кроме того, в них повышается уровень алкалоидов и общая жизнеспособность. Что касается других факторов, влияющих на развитие клеток, то здесь ученые не могут дать однозначного ответа на некоторые вопросы. Например, добавление предшественников не является гарантией роста клеток и синтеза метаболитов.

На основе многочисленных опытов ученые сформировали некоторые общие рекомендации по культивированию иммобилизованных клеток:

  • Клетки во время культивации должны быть неподвижны. Кроме того, их нельзя изолировать друг от друга. Для того, чтобы их физические и химические показатели не сильно отличались друг от друга, клетки должны находиться в тесном контакте;
  • Рост клеток необходимо постоянно контролировать путем регулирования подачи питательной смеси и уровня кислорода;
  • Предшественники клеток могут способствовать их росту, однако только в малых концентрациях. Для получения наилучших результатов стадия развития предшественников должна быть максимально близка к желаемому продукту;
Для культивации желательно использовать те клетки, которые обладают способностью секретировать метаболиты в питательную среду. Если таких клеток нет, можно взять образцы, у которых такую способность можно активировать.