Метод ДНК-комет

Генотоксичность, то есть повреждающее воздействие того или иного соединения на геном, и канцерогенность - связанные явления. Метод ДНК-комет позволяет оценить степень повреждения геномной ДНК как в эксперименте, в научных целях, так и при решении практических задач: оценке влияния окружающей среды или условий труда, контроле трансплантационного материала при размораживании, в тканевой инженерии. Повреждение ДНК, выявленное тестом ДНК-комет, может свидетельствовать и о предрасположенности к онкологии, и об изменениях, связанных с ней. Увеличение выявляемых ДНК-комет повреждений ДНК характерно для опухолевых клеток ^[1]. И, хотя за десятилетия с момента разработки, метод получил распространение только в специализированных областях, он может найти применение в диагностике и мониторинге лечения различных заболеваний ^[2]. Преимуществами ДНК-комет является чувствительность, невысокие требования к количеству материала, быстрый в исполнении протокол работы, относительная простота и невысокая стоимость ^{[1, 2]}.

Метод ДНК-комет применяется для исследования различных типов  клеток, как в культуре, так и в образцах биологических жидкостей и тканей ^[2]. Главным требованием для проведения анализа ДНК-комет является перевод клеток ткани суспензию, поэтому при вскрытии лабораторных животных изъятые фрагменты органов должны пройти соответствующую обработку, а клетки, содержащиеся в крови или сперме можно исследовать напрямую ^[1]. 80% злокачественных новообразований имеют эпителиальное происхождение. Эпителии, подвергающиеся и внешнему воздействию, и воздействию со стороны внутренней среды организма наиболее подходят для оценки генотоксичности методом ДНК-комет ^[2]. Неинвазивным способом получения эпителиальных клеток человека является мазок эпителия ротовой полости и отбор эксфолиативного материала эпителия слёзного канала. Клетки эпителия ротовой полости живут 10-14 дней, присутствие в них повреждённой ДНК свидетельствует о недавнем воздействии генотоксического соединения. Исследования целостности ДНК эпителия ротовой полости могут помочь при мониторинге воздействий веществ, связанных с профессиональной деятельностью и пищевых продуктов ^[2].

Клетки, помещённые в агарозу на стекле, обрабатываются лизирующим раствором, и, если необходимо, ферментами, специфичными к определённым нарушениям. Разделение проводится в щелочном буфере. ДНК выходит из клетки и движется на анод, образуя шлейф, который можно увидеть, используя флуоресцентный микроскоп. Чем больше разрывов происходит в ДНК, тем более выражено движение её фрагментов. После процедуры стёкла нейтрализуются и окрашиваются интеркалирующими красителями для визуализации ДНК. Оценка электрофоретической подвижности ДНК проводится с помощью флуоресцентного микроскопа ^{[1, 2]}. Когда практически вся ДНК клетки фрагментирована, это, как правило, погибшая клетка. Если единичные клетки имеют такую степень повреждения генома, они исключаются из анализа ^[1].

Наиболее часто используемый щелочной протокол ДНК-комет (разделение при pH > 13) позволяет выявить одноцепочечные разрывы, сшивки в ДНК и между ДНК и белками ^[2]. Использование в ходе пробоподготовки обработки щёлочью повышает восприимчивость метода, поскольку большинство генотоксических агентов не вносят двуцепочечного разрыва в цепи ДНК, а формируют одноцепочечные разрывы или участки с повышенной чувствительностью к щелочам ^[1]. Дополнительно применяются ферменты, вносящие разрывы в области ДНК со специфическими поврежденими. Формамидопиримидин ДНК-гликозилаза разрезает цепи ДНК в области окисленных нуклеотидов, формамидпиримидинов (аденина и гуанина с открытым кольцом) и других производных гуанина; OGG1 выявляет окисленные пурины и формамидопиримидины, эндонуклеаза III выявляет окисленные пиримидины, T4 эндонуклеаза V распознаеё димеры пиримидинов, 3-метиладенин ДНК гликозилаза II (AlkA) специфична к 3-метиладенину; а урацил ДНК гликозилаза выявляет ошибочно встроенный в ДНК урацил [3]. Такие протоколы обработки материала могут понадобится для решения специфических задач, например в замороженных тканях возрастает содержание окисленных пиримидинов и сайтов T4 эндонуклеазы V, а других нарушений не наблюдается. Метод ДНК-комет с обработкой соответствующим ферментом, может применяться для оценки состояния трансплантата перед пересадкой. ^[2]

Одна из сфер клинической диагностики, в которой применяется технология ДНК-комет - диагностика мужского бесплодия. В силу устройства сперматозоида, риск нарушений структуры ДНК в этих клетках повышен, а системы репарации полностью не компенсируют происходящие нарушения. При мужском бесплодии наблюдают повышенную степень повреждения ДНК сперматозоидов. Количество разрывов ДНК в сперматозоидах в норме достигает ∼10⁶ - 10⁷  на геном, как у человека, так и у лабораторных мышей, что гораздо выше количества разрывов генома в лимфоцитах или клетках красного костного мозга. Оплодотворение сперматозоидом, содержащим повреждения ДНК, активирует в ооците процессы репарации, восстанавливающие эти повреждения, но риск мутаций и врождённых заболеваний у ребёнка при этом повышается. Частота невынашивания беременности коррелирует со степенью повреждения ДНК сперматозоидов. С этим связана повышенная частота врождённых заболеваний и нарушений развития у детей при ИКСИ ^[4].

Метод ДНК-комет применяется не только для оценки состояния ДНК, но и для исследования процессов репарации в клетках. При этом исследуемые клетки разрушаются, а полученным гомогенатом обрабатывается ДНК, в которую предварительно вносятся повреждения определённого типа, в смесь добавляются нуклеотиды и АТФ, необходимые для репарации. По способности гомогената восстанавливать те или иные повреждения судят об активности систем репарации в клетках. Тип повреждения, который вносится в ДНК, зависит от того, какой механизм репарации исследуется. Например, для оценки эксцизионной репарации оснований применяют повреждённую светом ДНК, содержащую 8-оксогуанин, а эксцизионной репарации нуклеотидов - облучённую ультрафиолетовым светом ДНК, содержащую димеры пиримидинов. Одноцепочечные разрывы вносятся обработкой перекисью водорода, облучением рентгеновскими или гамма лучами, алкилирование ДНК проводится путём обработки метил-метансульфонатом. Для исследования эксцизионной репарации нуклеотидов используют оценку накопления разрывов ДНК при блокировании полимераз, участвующих в этом процессе с помощью афидоколина, или цитозин арабинозида в сочетании с гидроксимочевиной ^[3].

Анализ экспрессии генов, ассоциированных с репарацией, не всегда может быть объективным показателем состояния ДНК в клетках, поэтому метод ДНК-комет позволяет получить ценную дополнительную информацию. Повышенная активность систем репарации свидетельствует не только о том, что клетки более устойчивы к повреждениям генома, но и о том, что они подвергаются воздействию генотоксичного агента, в результате чего синтез белков, участвующих в репарации, активирован. Внесение в рацион Q10, витамина С в медленно растворяющихся капсулах, повышает активность эксцизионной репарации оснований. Сходный эффект наблюдается, если вместо препаратов использовать богатые антиоксидантами фрукты и овощи. При этом снижается активность системы эксцизионной репарации нуклеотидов, поскольку в ней отпадает необходимость ^[3].

Тест микронуклеусов является прямым показателем канцерогенности, руководство ICH рекомендует использовать его в сочетании с ДНК-комет ^[1]. Метод ДНК-комет можно сочетать с флуоресцентной гибридизацией FISH, чтобы определить, затрагивают ли изменения определённые участки генома ^[3]. Для анализа большого количества шлейфов ДНК, полученных в результате процедуры ДНК-комет. рекомендуется применять автоматизированные решения. Это позволит снизить субъективность оценки и более точно оценить размер и форму образовавшихся шлейфов, что особенно важно с учётом необходимости сбора данных по большому количеству шлейфов в каждом препарате. ДНК-комет может применяться в качестве метода для клинической диагностики и в исследовательских целях - для оценки генотоксичности того или иного соединения. ^[2]

 

 

 

Оценка воздействия гамма-лучей на ДНК лимфоцита с помощью метода ДНК-комет. Микрофотографии (А) и обработанные изображения (В).

Wang Y, Xu C, Du LQ, Cao J, Liu JX, Su X, Zhao H, Fan F-Y, Wang B, Katsube T, Fan SJ,  Liu Q. Evaluation of the Comet Assay for Assessing the Dose-Response Relationship of DNA Damage Induced by Ionizing Radiation / Int. J. Mol. Sci. - 2013. - V.14. N.11. - P.22449-22461.

 

 

Воздействие перекиси водорода на ДНК сперматозоидов моллюска Choromytilus chorus

 

Lafarga-De la Cruz F., Valenzuela-Bustamante M., Del Río-Portilla M., Gallardo-Escárate C. Genomic Integrity evaluation in sperm of Choromytilus chorus (Molina, 1782) by comet assay / Gayana. – 2008. – V.72. N.1. – P.36-44.

Полезная информация:

Где купить микроскоп

Флуорохромы

Люминесцентный микроскоп