Электронная микроскопия
Электронная микроскопия – один из основных методов для исследования и выявления вирусов. Именно на её данных строились первые, основанные на форме капсида, попытки классификации вирусов. Метод и сейчас используется для выявления вирусов. В этой области его главным преимуществом является отсутствие специфичности к какой-либо определённой группе вирусов, как у иммунологических или молекулярных тестов. Если в образце в достаточном количестве присутствует вирус, он будет выявлен электронной микроскопией, даже если к нему в принципе не существует диагностических антител, а его геном не изучен настолько, чтобы создать молекулярную диагностическую систему. Хотя метод и не всегда позволяет определить, какой именно вирус присутствует в материале, он даёт основание для дальнейшего исследования.
Вирусы в длительно хранящемся материале могут утрачивать жизнеспособность, а, в последствие, их генетический материал также может разрушаться. После этого присутствие вируса не установить ни культуральными, ни молекулярными методами. Однако электронная микроскопия справляется с этой задачей. Именно поэтому она позволила идентифицировать новые варианты вирусов, например, материале от диких экзотических животных.
Образцы биологических жидкостей могут быть подготовлены к исследованию методом электронной микроскопии в течение нескольких минут. При необходимости, частицы, содержащиеся в жидкости, могут быть сконцентрированы центрифугированием, как правило, все жидкие образцы центрифугируются перед исследованием по умолчанию, помимо стандартного центрифугирования может применяться ультрацентрифугирование, а также ультрафильтрация. Для исследования вирусов в клетках и тканях используют тонкие срезы. Для их получения материал фиксируют в глутаровом альдегиде, с последующей фиксацией/контрастированием осмием и, при необходимости, уранил ацетатом, обезвоживанием в разведениях спирта и ацетоне и заключением в эпоксидные смолы. В этом случае подготовка препарата может занимать до 36 часов. Повышение температуры до 95°C, применение микроволнового излучения и работа с очень небольшими образцами могут ускорить этот процесс до нескольких часов. Окраска же путём негативного контрастирования занимает около 15 минут.
По тому, как на препаратах представлено взаимодействие клеток и вирусов, можно судить о том, является вирус оболочечным или безоболочечным. РНК в зрелом состоянии не встречаются в ядрах. ДНК-вирусы (кроме оспы), наоборот, собираются в ядре. Таким образом, даже если вирус не идентифицирован окончательно, важную информацию для этого можно получить при его выявлении методом электронной микроскопии. Исследование замороженных образцов в специальном электронном микроскопе, оборудованном криостатом, в котором во время исследования материал содержится в жидком азоте и просвечивающая микроскопия проводится под различными углами, позволяет реконструировать трёхмерную структуру вируса с минимальным количеством артефактов.
Всё же, золотым стандартом выявления вируса является его выделение в культуру с последующей электронной микроскопией. Однако при этом следует учитывать, что клеточные культуры сами по себе могут быть заражены вирусами и микоплазмами, то есть необходим соответствующий контроль. В некоторых лабораториях проводят выявление вирусов методом электронной микроскопии в качестве рутинной процедуры. Электронная микроскопия используется, например, для контроля полиомовирусной инфекции почек у пациентов после трансплантации, в этом случае она является более быстрым и точным методом по сравнению с ПЦР. Дело в том, что данная инфекция есть у большинства людей, но содержание вируса таково, что путём электронной микроскопии в норме его не выявить. Опасным является именно выраженное накопление вируса в почках при иммуносупрессии. Диагностика должна проводиться с участием опытного специалиста, поскольку хроматиновые структуры и гранулы могут быть ошибочно приняты за вирусы. Высокая скорость проведения исследования позволяет рассматривать электронную микроскопию в качестве метода для выявления агентов биотерроризма, когда важна скорость исследования. Выявление вирусов путём электронной микроскопии – рекомендованный способ контроля стерильности препаратов, полученных из клеток и тканей.
Подробнее узнать о применении электронной микроскопии в вирусологии можно узнать из статьи, доступной по ссылке
Полезная информация:
Вернуться наверх