Расширение возможностей двухфотонной микроскопии: детекция по шести каналам

В последнее десятилетие мультифотонная микроскопия получила распространение в лабораториях, занимающихся биомедицинскими исследованиями, и стало стандартом доклинических исследований препаратов для лечения онкологических, аутоиммунных и сердечнососудистых заболеваний. Неинвазивное прижизненное наблюдение, осуществляющееся с помощью этого метода, позволяет многократно оценивать исследуемый процесс в организме одного и того же животного, его динамику и результат воздействия на него препаратов. 

В данном исследовании для модификации метода мультифотонной микроскопии с целью расширения числа оцениваемых параметров была выбрана модель мультиформной глиобластомы - агрессивной опухоли мозга с неблагоприятным прогнозом. Заболевание было исследовано в модели на мышах, полученной путём инъекции сфероидов опухолевых клеток в кору мозга. Участок инъекции закрывался закреплённым на кость покровным стеклом для последующего наблюдения. Клетки глиобластомы мыши были модифицированы таким образом, что в них накапливался репортерный белок DsRed. В организме трансгенных мышей также экспрессировались репортерные флуоресцентные белки, соответствующие клеткам разных типов. Коннексин43-CFP экспрессировался в астроцитах, Thy1-GFP в нейронах, CD11c-YFP - в реактивной микроглии и дендритных клетках. Наблюдаемая область мозга животного помещалась под 20X объектив с водной иммерсией.

В ходе микроскопии сигнал собирался от пяти детекторов в двух состояниях - при длинах волн возбуждения 800 нм и 940 нм. Система отбирала данные по 5 флуорофорам, CFP, GFP, YFP, DsRed а также carcade blue , окрашивающего сосуды, который вводился животным непосредственно перед экспериментом. Для детекции каждого из флуорохромов был выбран наиболее адекватный для него детектор (из пяти доступных) при соответствующей длине волны возбуждения (из двух). В твёрдой оболочке мозга и некоторых других участках наблюдалась генерация второй гармоники на коллагеновых волокнах, которая также воспринималась и включалась в анализируемое изображение. Таким образом, полученные изображения были шестицветными.

Генерация второй гармоники визуализируется только в верхнем слое твёрдой оболочки толщиной 50 мкм, поскольку её слабое голубое свечение легко рассеивается и поглощается живыми тканями. Из-за рассеяния и абсорбции спектральные профили флуорофоров на различной глубине наблюдения изменяются. Более выраженные рассеивающие свойства плотной и неорганизованной структурно опухолевой ткани дополнительно снижают боковое пространственное разрешение более выраженно, чем в прилегающих тканях. Более мощные лазеры с большей длиной волны, которые могут применяться для трёхфотонного возбуждения, могут позволить обойти данное ограничение.

Объектив 20X позволял исследовать поле зрения 400 × 400 микрон. Для реконструкции участков большего размера изображения сшивались между собой. Получение изображения от 9 полей зрения с глубиной оптического среза 3 микрон и проникновением вглубь образца 400 микрон занимает порядка 40 минут. Такие изображения опухоли можно получать, например, раз в сутки, что позволяет выявить перемещения клеток, например CD11c+ относительно неподвижной глии.

Динамическое одноцветное изображение может дать информацию о динамике роста опухоли, двуцветное - визуализировать дополнительно, например, прорастание сосудов в опухоль. С увеличением количества детектируемых меток возрастает детализация процесса.

Оборудование для электронной микроскопии, трансфекции и культивирования клеток, и даже для содержания животных.

Текст подготовлен по материалам исследования C.Ricard, F. Christian Debarbieux, доступного по ссылке .